鱟試劑測定法，作為藥典如USP<85>章所規(guī)定的關(guān)鍵方法，廣泛應用于細菌內(nèi)毒素的檢測。盡管其重要性不言而喻，但該方法的測量結(jié)果易受多種分析條件變化的影響，導致LAL（鱟試劑）測定的結(jié)果具有較高的可變性。這種可變性主要源自試劑質(zhì)量、待測產(chǎn)品特性以及檢測方法本身，尤其是在采用光度測定方法（包括顯色法和濁度法）時更為顯著。因此，本文深入探討了LAL測試變異性的原因，并著重闡述了通過實施有效的實驗室質(zhì)量控制措施來評估和減少這種變化的重要性。

一、鱟試劑測試變異性的來源

（一）鱟試劑

鱟試劑作為一種源自生物的復雜混合物，包含了多種酶和輔助因子，因其非單一純化酶的特性，使得每批裂解物的酶活性難以精確測量。此外，生產(chǎn)過程中引入的緩沖劑和表面活性劑進一步加劇了批次間的差異。為了評估每批鱟試劑的酶活性，制造商通常依賴美國藥典的內(nèi)毒素參考標準品（RSE），但鑒于RSE的稀缺性和高昂成本，多數(shù)實驗室轉(zhuǎn)而使用由鱟試劑供應商根據(jù)RSE評估確定的效力的細菌內(nèi)毒素工作標準品（CSE），這一做法無形中增加了測試結(jié)果的變異性。

（二）細菌內(nèi)毒素

實驗室制備的細菌內(nèi)毒素工作標準品（CSE）源自高度純化的大腸桿菌菌株，主要成分為脂多糖并添加了穩(wěn)定填充劑，而環(huán)境內(nèi)毒素則通常以未純化的形式存在，為大分子復合物，這導致了在利用CSE進行測定時兩者間存在差異。此外，盡管鱟試劑對細菌內(nèi)毒素具有高度特異性，但它僅能檢測細菌內(nèi)毒素分子中負責激活裂解物的脂質(zhì)A部分。值得注意的是，脂質(zhì)A部分可能形成未充分分散的聚集體，造成檢測不均勻，從而導致樣品中的細菌內(nèi)毒素含量被低估。此外，細菌內(nèi)毒素分子的化學特性和穩(wěn)定性隨時間推移而發(fā)生變化，這進一步影響了檢測結(jié)果的準確性。

（三）鱟試劑檢測法本身的變異性

LAL檢測法的變異性較高，范圍在50%至200%之間。這種變異性主要源于細菌內(nèi)毒素標準曲線的斜率以及多種測試輸入因素的變化，如試管、移液器吸頭、無菌技術(shù)、分析技術(shù)、移液方法差異、控制標準品制備差異、稀釋液配制變化等。此外，長期儲存稀釋液的變化、交叉污染、產(chǎn)品或樣品干擾、取樣容器、樣品儲存時間和溫度、LAL儀器/模塊變化等也會影響檢測結(jié)果，其中部分問題與檢測技術(shù)人員操作直接相關(guān)。

（四）內(nèi)毒素濃度

標準系列使用的細菌內(nèi)毒素濃度越小，誤差顯著性越大。例如，1.0至0.1EU/mL的標準曲線與5.0至0.005EU/mL的標準系列相比，前者在50%至200%的誤差影響范圍內(nèi)更為穩(wěn)定。這也是藥典中測試對照品可接受加標回收率為50%至200%的原因之一。

（五）稀釋誤差

測試稀釋尤其是稀釋細菌內(nèi)毒素和繪制標準曲線時可能出錯。為避免誤差，建議每批細菌內(nèi)毒素或裂解物常規(guī)使用前應由3名技術(shù)人員對稀釋系列鑒定并驗證3次。

常規(guī)檢測時，不同試驗稀釋順序應一致，且細菌內(nèi)毒素起始濃度應始終保持相同（通常為1000EU/mL），因為細菌內(nèi)毒素標準曲線是基于相同的細菌內(nèi)毒素起始濃度（1000EU/mL）繪制的，這一點可通過查看生產(chǎn)商分析證書或或?qū)Ρ燃毦鷥?nèi)毒素工作標準品（CSE）與美國藥典內(nèi)毒素參考標準品（RSE）來驗證。

（六）標準曲線

線性關(guān)系標準曲線的一致性是鱟試劑檢測的一個重要特征。線性標準曲線的y軸截距僅發(fā)生1%的變化，就會導致細菌內(nèi)毒素測定值發(fā)生30%至35%的變化。因此，控制濁度法LAL檢測的變異性時，需要密切關(guān)注起始（反應）時間。

二、評估差異的方法

盡管可以采取措施來降低變異，但遵循良好質(zhì)量控制的原則，實驗室仍需具備監(jiān)督和評估的手段，以確保檢測結(jié)果的滿意度，并判斷變異是否達到了值得關(guān)注的程度。其中一種有效的監(jiān)督方法就是審查變異系數(shù)（CV）。

（一）變異系數(shù)（CV）的應用

變異系數(shù)是衡量精確度的一個重要指標，以平均值的百分比表示標準差。在鱟試劑檢測中，CV通常表示為測試重復之間的百分比（%CV），可應用于標準曲線點和測試樣品復制。根據(jù)裂解物供應商設定的要求，常見的精確度要求是CV不超過10%或25%。%CV值越低，意味著不同測試副本之間的精確度越高，結(jié)果越接近。值得注意的是，隨著細菌內(nèi)毒素濃度的降低，%CV值通常會上升。此外，不同的鱟試劑供應商在鱟試劑檢測的驗收標準和計算%CV值的方法上存在差異。

（二）檢測稀釋錯誤

除了變異系數(shù)，稀釋誤差也是評估鱟試劑檢測準確性的重要方面。為了確保檢測的準確性，需要檢查標準曲線上細菌內(nèi)毒素最高濃度的起始反應時間，確保其處于預期的秒數(shù)范圍內(nèi)，因為即使是微小的起始時間變化也可能顯著影響線性度、斜率和Y-截距，從而對測試結(jié)果產(chǎn)生重大影響。

通過對歷史數(shù)據(jù)進行研究，特別是對前-100次使用細菌內(nèi)毒素的測試進行評估，可以確定起始細菌內(nèi)毒素濃度（如5.0EU/ml）的典型起始時間范圍。起始時間是檢測誤差的關(guān)鍵指標，因為它直接關(guān)系到光度法LAL檢測方法的原理，即裂解液與樣品或標準曲線稀釋液中的細菌內(nèi)毒素反應的時間越快，細菌內(nèi)毒素濃度越高。

根據(jù)平均值的第二個標準偏差，可以計算出起始濃度的光密度達到所需閾值所需的時間范圍。鑒于LAL檢驗本身存在誤差（通常認為誤差為±25%），為了與其他生物檢驗方法保持一定程度的標準化，第二個標準差可以說是最合適的測量方法。標準差是衡量單個元素偏離平均值（均值）的程度。其計算公式為方差的平方根（如圖1所示）。

在LAL檢測中，使用平均值的兩個標準差來界定起始時間的正常范圍，能確保95%的測試值落在該范圍內(nèi)，超出此范圍的5%則被視為非典型值。每次檢測后，需將最高細菌內(nèi)毒素濃度點的起始時間與這一范圍進行對比，以驗證檢測的合格性。

（三）標準曲線相關(guān)系數(shù)

每次測試都應檢查標準曲線的相關(guān)系數(shù)（要求相關(guān)系數(shù)大于或等于0.980），這是藥典要求。標準曲線的一致性很重要，線性標準曲線Y-截距的微小變化會導致細菌內(nèi)毒素測定結(jié)果大幅變化。

（四）陰性對照

每次檢測都要進行陰性對照，陰性對照是構(gòu)建標準曲線的水樣，可顯示制備細菌內(nèi)毒素系列時是否污染，其細菌內(nèi)毒素含量必須低于標準曲線中的最-低細菌內(nèi)毒素濃度（常規(guī)標準系列為0.05EU/mL），這也是藥典要求。

影響LAL檢測的變異性和測試誤差來源眾多，技術(shù)人員在設計檢測方法和調(diào)查檢測異常時，了解這些因素至關(guān)重要。變異系數(shù)是衡量變異性的關(guān)鍵指標，技術(shù)人員審查測試結(jié)果時需重點檢查，同時結(jié)合檢測稀釋錯誤、標準曲線相關(guān)系數(shù)和陰性對照等方面的評估，做好實驗室質(zhì)量控制，以確保LAL檢測結(jié)果的可靠性。